Il ruolo dell'HIV DNA non integrato

Intervista con il Dr. Mark Wainberg, Mc Gill University AIDS Centre, Jewish General Hospital, Montreal, QC , Canada.

Dr. Mark A. Wainberg e' capo della ricerca sull'AIDS al Lady Davis Institute per la Ricerca Medica, Direttore della McGill University AIDS Centre e Professore di Medicina e Microbiologiae Immunologia al Mc Gill University a Montreal.
Il Laboratorio del Dr. Wainberg ha recentemente fatto una relazione scientifica discutendo il ruolo delle forme del DNA virale nella patogenesi dell'HIV e come reservoir virale. Ha gentilmente acconsentito a rispondere ad un paio di domande.

Alain Lafeuillade Quali sono le differenti forme di HIV DNA non integrato trovate durante l'infezione HIV e qual'e´il loro significato?
Mark Wainberg : l'HIV DNA puo' esistere in almeno tre forme.
Primo il DNA provirale lineare e' il prodotto che viene trascritto dall'RNA genomico virale dall'enzima trascriptasi inversa nel citoplasma delle cellule infette. Questo e' il DNA virale che e' direttamente responsabile nel trasmettere l'infezione attraverso l'integrazione nel genoma della cellula ospite. Questo DNA e' percio' capace di attraversare dal citoplasma dove viene fatto al nucleo, dove l'integrazione e' mediata dall'enzima virale integrasi. Il processo di tale transizione e' esso stesso complesso e implica un complesso pre-integrazione (PIC) che interessa RT, integrasi e il DNA virale; questo complesso e' capace di penetrare attraverso pori nucleari per guadagnare l'entrata nel citoplasma.
Le altre forme di DNA virale non integrato che sono state scoperte nelle cellule infettate sono forme circolari che contengono o una o due copie dell'LTR virale. Queste forme di DNA virale non si integrano nel genoma dell'ospite e sono trovate esclusivamente nel nucleo dove sono generate dal DNA lineare. Nonstante il fatto che non possono integrarsi nel DNA cellulare, esse non possono neppure essere trascritte per produrre prodotti genetici. Come spiegato piu' avanti, i secondi prodotti possono avere un significato fisiopatologico, come lo possono avere le stesse forme di DNA circolare virale.

AL: dove sono situate queste forme di DNA non integrato, e qual'e´la loro relazione con l'HIV DNA provirale?
MW: Tutte le forme di DNA derivano dal cDNA lineare che e' esso stesso non integrato. Il cDNA lineare e' il prodotto della trascrizione inversa del genoma virale RNA e il precursore del provirus integrato. Quindi il cDNA non integrato lineare sara' trovato sia nel citoplasma della cellula che nel nucleo. Mentre i circoli dell'HIV 1-LTR e 2-LTR sono stati trovati esclusivamente nel nucleo,la formazione del circolo 2-LTR e' completamente dipendente dall'ospite non-omologo che si unisce ai fattori di riparazione del DNA. La formazione del circolo 1-LTR puo' sorgere attraverso la ricombinazione , ma sono anche coinvolti i fattori di riparazione del DNA dell'ospite. Questo puo' spiegare perche' i circoli sono stati trovati solo nei nuclei delle cellule. Solo il cDNA lineare puo' intyegrarsi e diventare provirus. I prodotti circolari sono incapaci di sostenere la replicazione da loro stassi, ma possono esprimere uin limitato set di geni.

AL: Quali interazioni sviluppano con i fattori cellulari dell'ospite?
MW: Il cDNA viene riconosciuto dalla cellula come un danno al DNA o possibilmente come un patogeno. I circoli 1-LTR possono sorgere attraverso gli effetti mediati dalla nucleasi RAD50/MRE11/NBS1 sul cDNA lineare. I circoli 2-LTR sorgono attraverso gli effetti dei componenti NHEJ Ku, ligasi 4 o XRCC4 o cDNA lineare. Possibilmente la subunita catalitica della proteina kinasi DNA-dipendente (DNA-PKcs) ha anche un modesto effetto nei suoi riguardi. Ci sono dei buoni dati preliminari che XPB e XPD, che sono elicasi del DNA cellulare che sono componenti del complesso basale di trascrizione TFIIB che gioca un ruolo nella riparazione dell'escissione del nucleotide DNA , puo' direttamente degradare il cDNA lineare piuttostto che renderlo circolare.
Similarmente, la ricombinazione omologa della proteina di riparazione del DNA Rad52 e' stata riconosciuta come possibile diretta degradazione del cDNA lineare. Inoltre , il fattore di restrizione dell'ospite APOBEC3G si e' dimostrato modifichi il cDNA lineare, rendendolo inadatto all'integrazione. C'e´anche una prova che l'espressione genetica del Dna non integrato e' regolata attraverso la modificazione epigenetica del DNA virale non integrato dall'ospite, ma i precisi meccanismi non sono chiari.
Complessivamente, la relazione tra la sensibilita' del patogeno, la riparazione del DNA, e l'immunita' innata resta un'area interessante e relativamente inesplorata dell'HIV.

AL: qual'e´il loro ruolo nella storia naturale della malattia dell'HIV?
MW: La presenza di DNA non integrato prima dell'integrazione e' stato legato all'attivazione e alla probabilita' dell'infezione produttiva nelle cellule T a riposo attraverso l'espressione di Tat e Nef dal DNA non integrato. Molti studi usano il blocco dell'integrazione per mimare lo stato preintegrazione; in queste circostanze, puo' essere visto che CD4, CCR5 e CXCR4 sono sottoregolati dal Nef, portando ad una restrizione degli eventi della superinfezione, che possono spesso nascondere l'infezione. Abbiamo anche visto che le molecole HLA che sono state localizzate dalle cellule citotossiche T (CTLs) sono state sottoregolate dal Nef mentre quelle che sono state localizzate dalle cellule Natural Killer non vengono colpite dal Nef. QUindi , l'espressione del Nef precedente all'integrazione dovrebbe aiutare all'evasione immunitaria. Per le cellule con piu' lenta cinetica di replicazione virale, quali i macrofagi e le cellule T quiescienti, la traslazione preintegrazione dei precoci geni virali potrebbe condurre ad un esteso periodo di beneficio per il virus.

AL: qual'e´il loro destino durante la terapia antiretrovirale?
MW: Gli inibitori dell'integrasi, quali il Raltegravir, conducono ad una proliferazione di DNA non integrato (circa da 1,4 a 2 volte) dovuto alla piu' grande disponibilita' di substrato per le vie NHEJ quando l'integrazione viene bloccata. Ma le forme di DNA non integrato non possiedono un origine di replicazione, e percio' diventano dissipate nella popolazione complessiva con ciascuna divisione cellulare. Con un rapido ricambio dei linfociti in PMBCs l'insorgere di 2-LTR e' visibile solo per alcune settimane durante la terapia con raltegravir. Tuttavia se i prodotti non integrati sono in cellule che si dividono molto lentamente o non si dividono, possono persistere.

AL: che prova abbiamo che potrebbero partecipare al reservoir HIV?
MW: C'e´una molto buona prova che l'HIV DNA non integrato puo' persistere ed esprimere geni nei macrofagi per oltre 30 giorni (nel cui momento gli esperimenti sono stati fermati). I vettori della terapia genetica lentivirale non-integrante sono stati scoperti nelle cellule non in divisione di animali infettati sperimentalmente per oltre un anno dopo l'infezione. I virus in questa circostanza non sono infettivi, poiche' sembra che vengano espressi solo i geni precoci (Tat, Nef, Rev), ma tali virus possono essere recuperati da virus entranti che possono complementare l'infezione non integrata. Inoltre se il complesso preintegrazione (PIC) e' ancora intatto, la stimolzaione di una cellula T a riposo potrebbe recuperare l'infezione da un blocco preintegrazione, un fenomeno conosciuto come latenza preintegrazione. Tuttavia, tutti questi stati sono contributi relativamente minori comparati ai reservoir latenti che si sono stabiliti durante l'infezione delle cellule T CD4+ che stanno passando ad uno stato di riposo.